尊龙凯时

生涯条件

液氮生涯

细胞作育基

DMEM+10% FBS+1% GlutaMax

冻存作育基

70%完全作育基+ 20% FBS+ 10% DMSO

细胞苏醒要领

注重：收到的细胞如 24h 内苏醒，可存放于-80℃冰箱
；凌驾 24h 请存放于液氮中，苏醒前 10min 取出，放于-80℃，让管中液氮挥发。
1．水浴锅 37℃预热
；
2．适合该细胞系的完全作育基温浴到 37℃
；
3．在 15mL 离心管中加入 6mL 完全作育基备用
；
4．从-80℃冰箱中取出细胞，在 37℃水浴中轻轻转动冻存管，直到冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞在 1min 内迅速解冻（水不可没过盖子或用封口膜把冻存管口封上）
；
5．将冻存管转移到超净事情台内
；翻开盖子前，用 75％酒精擦拭冻存管外部
；
6．用移液枪吸收细胞冻存悬液，转移至已预热的完全作育基的离心管内
；
7．用 1mL 完全作育基洗涤冻存管 1 次，网络残留细胞，镌汰损失
；
8． 细胞悬液以 1100rpm 离心 4min（离心速率和时间取决于细胞种类）
9．离心后，检查上清液是否清亮，有无完整的细胞沉淀
；在无菌条件下，小心倒掉上清液，加入 1mL 完全作育基，轻柔奏乐细胞沉淀，充分吹散、混匀
；
10．将细胞平均接种到 1 个 T25 作育瓶或底面积相当的作育容器中。加入足量完全作育基，1 个 T25 作育瓶中作育基总量不少于 6mL（现实作育瓶尺寸取决于冻存管冻存的细胞数目）
；
11．摇匀细胞，放入 37℃、5％CO2、饱和湿度的作育箱中（作育情形取决于细胞和作育基类型）
；
12．苏醒越日，视察细胞状态。
（1）贴壁细胞若细胞贴壁情形优异，可以替换新鲜的完全作育基
；若视察到细胞呈圆亮形态但不贴壁，可以让细胞继续作育 24h 后再举行换液操作。之后，凭证细胞的生长状态，每2-3 天替换一次完全作育基，视察细胞，生长至 80％以上的汇合度，即需传代。若细胞生长较慢或汇合度较低时，可以镌汰换液次数。
（2）悬浮细胞苏醒后只管放在相对小一些的容器中，使用含 20％血清的作育基苏醒。悬浮细胞若细胞状态优异，可以替换新鲜的完全作育基
；若细胞状态差且泛起灰度，可以继续作育 72h 后再视察细胞。视察发明有活细胞，可举行换液操作，视察细胞无显着转变，实时反响本公司售后。

细胞传代要领

1.使用显微镜视察细胞，以评估融合水平并确认不保存细菌和真菌污染物。首先轻小扣击作育瓶，这样可以将细胞从作育瓶壁脱落，阻止在胰卵白酶消化历程中，由于相关洗涤而使一些细胞会损失。
2.将含有细胞的作育基转移到无菌离心管中。
3.用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤任何剩余的贴壁细胞，转移洗涤液至无菌离心管中。
4.将1ml/25cm2外貌积的胰卵白酶/EDTA滴到细胞单层上。旋转作育瓶，使胰卵白酶笼罩所有细胞。
5.将作育瓶放回作育箱中，静置2-10分钟。
6.使用倒置显微镜检查细胞，以确保所有细胞疏散并漂浮
？梢郧崆崤拇蜃饔康牟嗝，使剩余的附着细胞脱落。
7.将细胞转移到含有保存的作育基和细胞的离心管中。
8.将整个细胞悬浮液以150 x g离心5分钟。
9.取出上清液，将细胞沉淀重新悬浮。并计数。
10.用移液管将所需数目的细胞移到新的作育瓶中，并使用完全作育基稀释至所需体积。
11.凭证需要，每2-3天重复一次此历程。

传代比例

用皿作育，1/5-1/8，48 h内传代